HPLC溶剂的选择及使用二三事
由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度要求较高，不纯的溶剂会引起基线不稳或产生“伪峰”。此外，溶剂的极性也要与待测样品、检测器匹配等等。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响纯化分离，且会使柱子恶化。那么，我们在HPLC溶剂选择的时候，需要遵循哪些原则呢？
表1、常用溶剂在不同波长下的吸收值：
溶剂 波长 | 200nm | 205nm | 210nm | 215nm | 220nm | 230nm | 240nm | 250nm |
乙腈 | 0.05 | 0.03 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 |
甲醇 | 2.06 | 1.00 | 0.53 | 0.37 | 0.24 | 0.11 | 0.05 | 0.02 |
THF | 2.44 | 2.57 | 2.31 | 1.80 | 1.54 | 0.94 | 0.42 | 0.21 |
醋酸1% | 2.61 | 2.63 | 2.61 | 2.43 | 2.17 | 0.87 | 0.14 | 0.01 |
磷酸0.1% | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 | ＜0.01 |
三氟乙酸 | 1.20 | 0.78 | 0.54 | 0.34 | 0.20 | 0.06 | ＜0.01 | ＜0.01 |
三乙胺1% | 2.33 | 2.42 | 2.50 | 2.45 | 2.37 | 1.96 | 0.50 | 0.12 |
1、流动相溶剂的选择：
流动相溶剂的正确选择对于高效液相色谱分析(HPLC)的成功与否非常重要。目前还没有一个较为理想的选择模式，主要依赖于经验的积累。
流动相溶剂选择的一般要求是： (1)溶剂应当是高纯度，溶剂与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性；(2)溶剂的性能与使用的检测器应当匹配；(3)溶剂对样品应有足够的溶解能力；(4)溶剂应具有低的粘度和适当低的沸点；(5)尽量避免使用具有显著毒性的溶剂。在选择流动相溶剂时，可以从影响分离度R 的因素即柱效、分离因子a和容量因子来考虑。选择溶剂时首先应排除一些物理性质(如沸点、粘度、紫外吸收等)不适于在液相色谱中使用的溶剂，然后选择能使分析样品中组分的容量因子值保持在1～1O之间、洗脱强度适当的溶剂。对含多组分的样品、值可扩展在0.5～20之间。在选出适用值的溶剂当中，还要进一步选择能将样品中的不同组分分离开、且能使每个相邻组分的分离因子a大于1.05的溶剂。所选择的适用Ic，和a的溶剂还必须与能提供高理论塔板数的色谱柱相组合。因此，作为一个色谱工作者，熟悉表征溶剂物理和化学特性的重要参数，如溶剂强度参数￡、溶解度参数δ、极性参数P、粘度η等，对液相色谱法流动相溶剂的选择会起到十分重要的作用。
能够作为液相色谱流动相使用的溶剂有100多种，但实用的溶剂只有少数几种。在实验室中有了甲醇、乙腈、水、四氢呋喃、正己烷、二氯甲烷，就能够解决9O％以上的色谱分离问题。
2、溶剂的处理和更换
液相色谱溶剂应尽量使用HPLC级溶剂。HPLC级试剂是用特殊方法生产的含有最少的微粒和最低的紫外吸收物质。水也应达到HPLC级。液相色谱实验室应配有纯水发生器。非色谱纯溶剂可通过蒸馏方法进行提纯，除掉大部分有紫外吸收的杂质。另外，用氧化铝或硅胶柱可除去极性强的化合物。
理论上，完全由HPLC级溶剂组成的流动相不必过滤（但因操作过程中，因溶剂本身，容器、环境等原因，建议在进入系统使用前使用相应的滤膜进行过滤操作），其他溶剂由于含有不溶性微小颗粒，会逐渐堆积在色谱柱中堵塞流动相的通道，使柱压力升高，柱效率下降，因此使用前一定要用0.2～0.5um 的过滤器过滤。当使用固体化学试剂(如缓冲盐)配制流动相时过滤特别重要，不能让固体微粒污染泵的单向阀、阻塞、损坏进样器和柱头过滤片。现有过滤器有水溶性和脂溶性两种过滤膜供选择。过滤水溶性流动相时(如甲醇／水)，先用1～2 mL甲醇润湿过滤膜，有助于快速抽滤。
流动相在使用前必须进行脱气处理(连同贮液器一起脱气效果更好)，以除去其中溶解的气体，防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。若在死体积检测池中，存在气泡会增加基线噪声，严重时会造成分析灵敏度下降。流动相中的氧气对光电检测器影响最大，使紫外检测器基线增高，低波长检测时信号被抵消掉。在荧光检测中O2会使样品的荧光淬灭，降低灵敏度，还会导致某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有① 氦脱气；② 加热回流；③ 真空脱气；④ 超声波脱气。从脱气速度和效果看，加热回流法最好，但操作不方便，存在着火的危险。对于混合流动相不提倡用此法，因为挥发性组分会损失掉，改变流动相的组成。超声脱气法只能除去3O 的溶解气体效果最差。近年来新出现的在线真空脱气法(on—line degasser)，把真空脱气装置串接到贮液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进人输液泵前的连续脱气。其脱气效果明显优于上述4种方法，并适用于多元溶剂体系。
在HPLC中需要经常更换新溶剂。更换溶剂时，必须将原有的溶剂冲洗干净。如果新旧溶剂是互溶的，则必须保证新溶剂使色谱柱重新达到平衡。否则将产生基线漂移。若新旧溶剂不互溶，则要选择与原溶剂和新溶剂(正相和反相)都相溶的过渡溶剂冲洗，然后再用新溶剂冲洗。如异丙醇是1种很理想的过渡溶剂。特别要注意防止新旧溶剂发生反应或生成沉淀物，否则将给管路、泵及检测器带来污染和堵塞，给清洗工作带来麻烦。
如果缓冲液反相流动相被正相流动相所污染，产生缓冲盐沉淀，可用5倍柱体积的非缓冲液反相流动相冲洗系统，再用10倍柱体积的强溶剂(如乙腈)通过系统，最后用50倍柱体积的异丙醇冲洗系统，以除去所有滞留的流动相和溶剂残留，换上反相流动相冲洗，使系统重新平衡。如果正相流动相被水溶性溶剂所污染，先用50倍柱体积的异丙醇冲洗，而后用正相流动相冲洗。在分析样品前，最少需用10倍体积的最终流动相冲洗系统。
3、溶剂与检测器的匹配
在使用紫外可见光检测器时，需选用无紫外吸收特性的溶剂作流动相。样品测定波长应当在溶剂紫外吸收波长上限以上，噪声降至10-4 ～ 10-5AU，才能保证检测的灵敏度，才能用于梯度洗脱。流动相溶剂在整个梯度范围内互溶性要好，尽量减少溶剂折光指数对溶剂组成梯度的影响。溶剂折光指数的改变会导致紫外吸收度的变化，使紫外检测器产生噪音和漂移。因此，当使用两种或两种以上溶剂做梯度时，其折光指数应该尽量接近，尽量减少溶剂紫外吸收度改变的影响。
在使用示差折光检测器时，应使流动相的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能大的差别，因为二者的折射率差别越大，检测器的响应信号越大，检测灵敏度越高。示差折光检测器一般不用于梯度洗脱，这是因为随溶剂组成的改变，流动相的折光指数也在改变，无法使基线稳定。
使用荧光检测器时，不能使用可熄灭、抑制或吸收荧光的溶剂作流动相。溶剂的极性和溶液的温度对荧光强度有明显的影响。增大溶剂的极性，导致荧光增强。通常荧光物质溶液的荧光效率和荧光强随着温度的升高而降低。此外，当样品浓度较高时，易引起荧光猝灭效应和内滤效应，溶液浓度越大，该效应越显著，溶液中的其它成分，特别是顺磁性物质的存在，将使猝灭效应加剧。因此，在进行荧光检测时，试样要配成低于10-6 g／mL浓度的溶液，要使用不含荧光物质的溶剂。
电化学检测器所用的流动相必须具有导电性。安培检测器采用的流动相中必须有常用浓度范围为0.01 mol／L-0.1 mol／L电解质(如含盐的缓冲液)存在。流动相要有足够高的介电常数，使电解质充分解离。流动相在电极表面呈电化学惰性，工作电压下背景电流小。
为什么乙醇、丙醇、丙酮不被用做流动相？
研究表明，当流动相的A>0.7的时候，基线噪声会显著增加，一般选择的吸收值<0.5。当A>1.0时，基本就不能用使了。对于示差折光检测器，主要考虑样品和流动相的折光率，这里不 再赘述。
选用的溶剂粘度要低、沸点适中使用低粘度溶剂，可减小容质的传质阻力，降低柱压，利于提高柱效。从分离制备和色质连用考虑，沸点要适中，低沸点的溶剂有它的优点;但仅仅用 于分析，沸点太低，反而由于溶剂的挥发，造成保留时间的变化。
尽量不用高毒性的溶剂不只是环境，单从我们自身的安全考虑，当然用低毒溶剂最好。
溶剂对样品有足够的溶解力样品如果不能溶解在选用的溶剂里，还怎么分析?
但如果样品在流动相里溶剂仍然不大，可以用样品的最佳溶剂先溶解，再用流动相稀释，就 可以了。
知道了上面选择溶剂的一般原则，就不难理解为什么不同乙醇、丙醇做流动相的原因了，因 为它们的粘度大。 还有丙酮，虽然粘度和毒性较低、溶解度大、极性适中，但用于它的截至吸收波长为330nm， 所以不常用，如果样品的吸收大于330nm，其实用丙酮是一个不错的选择。
（本文由实验与分析编辑整理，转载请注明出处）
小贴士：
1.亲，这里有一大波活跃的技术群来袭：实验与分析人社区、实验室j建设与管理、样品前处理技术群、重金属检测技术群、色谱技术群、红外光谱应用技术群等，想加入群组的亲请联系小析姐casellihuang接受定向邀请。
2.亲可以拉到底部参与评论哦，另，分享创造价值呢！